PKA,小鼠蛋白激酶A酶聯免疫試劑盒技術指導
l 本試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織、細胞上清及相關液體樣本中小鼠蛋白激酶A（PKA）的含量。
l 有效期：6個月
l 保存條件：2-8℃
l 本試劑盒僅供體外研究使用，不用于臨床診斷
實驗原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被小鼠蛋白激酶A（PKA）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的小鼠蛋白激酶A（PKA）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。
PKA,小鼠蛋白激酶A酶聯免疫試劑盒技術指導準備試劑與收集血樣
1. 收集標本：血清、血漿（EDTA）、細胞培養上清液、組織勻漿等裂解產物盡早檢測，2-8℃保存48小時；更長時間須冷凍（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反復凍融。
2. 標準品液配制：使用前加入0.5ml蒸餾水混勻，配成16000pg/ml的溶液。設標準管8管，每管加入標本稀釋液200ul。在*管中加入16000pg/ml的標準品溶液200ul混勻后用加樣器吸出200ul，移至第二管。如此反復作對倍稀釋，從第七管中吸出200ul棄去。第八管為空白對照。
3. 10×標本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。
4. 洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）
標本激活方法
1. 將450ul標本稀釋液加入到一支1.5ml進口聚丙烯管中,再加10ul血清或血漿標本。
2. 加20ul 1 N HCI,蓋緊，上下混勻。2－8℃放置60± 2分鐘。
3. 加20ul 1 N NaOH,蓋緊，上下混勻。
4. 即用，或放-20/-70℃保存3天。計算結果時乘以稀釋倍數50。（注意：不同的標本HSP60的水平可能有較大差異，請根據實際情況靈活掌握稀釋度）
5. 細胞培養上清或組織勻漿10倍稀釋(410ul的標本稀釋液＋50ul樣本＋20ul的1N HCI+20ul的1N NaOH)。
改良雙抗體夾心法
本法是雙抗體夾心法的一種改良形式，也是用于測定抗原的，其原理可用圖來表示。本法首先是將特異性抗體a包被于固相載體，經洗滌加入含有欲測抗原之待檢樣品。經孵育洗滌后再加一次未標記的特異性抗體b，而這次加入的抗體b于*次包被于固相載體上的特異性抗體a對被測抗原來說都是特異性的，但不是用同種動物免疫制備的，否則可出現非特異性反應。經孵育洗滌后，再加酶標記抗b抗體，再經孵育洗滌后加底物顯色進行測定。這種方法與雙抗體夾心法不同之處是多加了一層抗體。因此，放大的倍數更高，故比雙抗體夾心法更加靈敏。同時避免標記特異性抗體，而另一優點是只要標記一種抗抗體，即可達到多種應用。
檢測程序
1. 加樣：每孔各加入標準品或待測樣品（已激活）100ul，將反應板充分混勻后置37℃120分鐘。
2. 洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。
3. 每孔中加入*抗體工作液100ul。將反應板充分混勻后置37℃60分鐘。
4. 洗板：同前。
5. 每孔加酶標抗體工作液100ul。將反應板置37℃30分鐘。
6. 洗板：同前。
7. 每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗處反應15分鐘。
8. 每孔加入100ul終止液混勻。
9. 30分鐘內用酶標儀在450nm處測吸光值。
結果計算與判斷
1. 所有OD值都應減除空白值后再行計算。
2. 以標準品8000、4000、2000、1000、500、250、125、0 pg/ml為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上作圖，畫出標準曲線。
3. 根據樣品OD值在該曲線圖上查出相應HSP60含量，再乘上稀釋倍數即可。
試劑盒性能
1. 靈敏度：zui小的HSP60 檢測濃度小于65pg/ml。
2. 特異性：可同時檢測重組或天然的人HSP60。不與人其它細胞因子有交叉反應。
3. 重復性：板內、板見變異系數均小于12％。
注意事項
1. 以上標準孔及待測樣品均建議做復孔，每次測定應同時做標準曲線。
2. 洗滌過程很關鍵。洗滌不充分將導致精確度誤差及OD值錯誤地升高。
3. 板條開封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。
4. 本試劑盒宜置4oC冰箱保存。
5. 本試劑盒僅用于科研，不能用于臨床診斷！
